Isolement et identification des souches productrices de lipase.

Abstract

La demande en thermo-enzymes pour des applications biotechnologiques est de forte croissance. Les lipases sont, parmi les enzymes thermophiles, les plus recherchées dans divers secteurs industriels. Les objectifs de ce travail étaient l’isolement et l’identification des souches thermophiles productrices de la lipase à partir des sources thermales de différentes wilayas d’Algérie, L’optimisation des conditions impliquées dans la production de la lipase par ces souches, leur purification et l’étude des propriétés catalytique de la lipase sont mise en évidence. Le criblage primaire des souches productrices de la lipase sur milieu minimal contenant une concentration de 1% de l’huile d’olive et de tween 80 comme seul source de carbone a permis l’isolement de 59 souches bactériennes thermophiles aérobies. Le criblage secondaire a permis la sélection de 5 souches productrices de la lipase très performantes. L’utilisation des galeries API (20E, 20NE) et l’interprétation probalistique des résultats obtenus a permis l’identification des souches sélectionnées comme étant : GH5 : Geobacillus, S5 : Bacillus subtilis, HB5 : Pseudomonas fluorescens, WO4 : Bacillus licheniformis, HR2 : Bacillus cereus. Différents paramètres impliqués dans la production de lipase et la biomasse tels que la température, la source de carbone et d’azote, la durée d’incubation, la concentration de l’inoculum, la valeur de pH ont été optimisés. Les résultats obtenus ont montré que l’inoculation des souches sélectionnés (WO4, GH5, HB5, HR2, S5) sur milieu de culture minimal, incubées à une température de 50°C pendant un temps d’incubation 72 heures a donné une production maximale (35000, 33000, 2 9000, 26000, 24000µmol/ml/min). La purification partielle de la lipase chez les souches sélectionnées productrices a été effectuée en étapes successives : Dans un premier temps, les protéines sont fractionnées par précipitation au sulfate d’ammonium, ensuite dialysées dans une solution tampon de phosphate de potassium pendant une heure. Dans un second temps, la fraction protéique active est ensuite soumise à une purification partielle sur chromatographie d’échange d’anion (DEAE de cellulose). L’activité enzymatique des lipases produites chez les cinq souches sélectionnées est maximale à des valeurs de pH comprise entre 7-10 et une température de 50-70°C. La purification de la lipase produite chez les souches (S5, HR2, HB5, GH5, WO4) par précipitation au sulfate d’ammonium (40% et 60%) et la chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose, a donné les rendements respectifs (19,4, 19,38, 18,1, 17,4, 19,4 %). L’activité enzymatique de la lipase se manifeste stable à des valeurs de pH comprise entre 5-10 et à des températures situées entre 60-90°C pendant un intervalle de temps d’une heure. Par ailleurs, L’activité enzymatique de la lipase est fortement stimulée en présence des ions de Ca+2 et Mg+2 à une concentration de 1mM. Cependant, la présence de certains métaux tels que le Cu+2, Zn+2 et Mn+2 à une concentration de 1mM a manifesté un effet d’inhibition.